2.10: Adición Nucleofílica de\(OH^{-}\) and \(H^{-}\)

^{La adición nucleofílica de iones OH como paso en las vías enzimáticas no se restringe a procesos hidrolíticos; a menudo ocurre en liasas, la clase de enzimas que catalizan la eliminación (o incorporación en la reacción inversa) de moléculas neutras como H ₂ O, pero también NH ₃, CO} ₂, etc.—de un sustrato. Está fuera del alcance de esta sección revisar todos los demás mecanismos involucrados en las reacciones de liasa, especialmente porque no son reducibles a pasos comunes y porque varios de ellos no requieren la presencia de un ión metálico. Nos limitamos a la eliminación (o incorporación) de H _2O, una característica generalizada de la cual parece ser la división del agua en los constituyentes H ⁺ y OH ^- iones en algún paso del mecanismo. Como ejemplo, la deshidratación de 2-fosfo-D-glicerato a fosfoenolpiruvato catalizada por enolasa, una enzima activada por Mg,

\(\tag{2.21}\)

se ha demostrado mediante estudios cinéticos de efecto ^{isotópico 150} que procede a través de la rápida eliminación de H ⁺ del sustrato seguida de liberación lenta del producto, y finalmente por liberación de OH ^-. El papel de un ion metálico como el magnesio podría ser activar el sustrato coordinando el grupo fosfato, en lugar de proporcionar un hidróxido coordinado para el ataque nucleofílico.

Otras liasas, sin embargo, contienen iones de metales de transición [a menudo hierro (II)], y su papel principal bien podría ser el de disminuir el pK _a del agua. Ninguno de ellos, sin embargo, se conoce lo suficientemente bien como para permitir una discusión detallada del mecanismo molecular. Una excepción llamativa es la anhidrasa carbónica, la cual ha sido tan extensiva y exitosamente estudiada que es ideal como estudio de caso (Sección IV).

La transferencia de hidruro es otro proceso elemental que se encuentra en muchas reacciones enzimáticas. Aunque la transferencia de hidruro implica una reacción redox, también implica un ataque nucleofílico sobre el sustrato como en los ejemplos anteriores. A diferencia del OH ^-, los iones hidruro no existen en soluciones acuosas como iones libres. En sistemas biológicos, el hidruro siempre se transfiere directamente de un resto orgánico a otro por rotura simultánea y formación de enlaces covalentes. La energía de activación para este proceso es mucho mayor que, por ejemplo, la de la transferencia de H ⁺ a través de la formación de enlaces de hidrógeno. Además, a diferencia de las especies unidas por hidrógeno, no hay ningún intermedio en el proceso que pueda ser estabilizado por el catalizador. En cambio, las especies reaccionantes pueden desestabilizarse para disminuir la barrera de energía de activación. El papel de la enzima, y del ion metálico cuando está presente, es proporcionar sitios de unión para ambos sustratos. La enzima logra esto tanto geométricamente, al permitir una orientación adecuada de los grupos, como electrónicamente, proporcionando energía para superar la barrera de activación.

Estos conceptos generales pueden ser ejemplificados por alcohol deshidrogenasas hepáticas (LADH), enzimas diméricas de zinc de 80 kDa que catalizan la siguiente clase de reacciones usando el sistema NADH/NAD ⁺ como coenzima (o, realmente, como cosustrato):

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En particular, los LADH catalizan la deshidrogenación reversible de alcoholes primarios y secundarios a aldehídos y cetonas, respectivamente. Otras actividades enzimáticas de LADHs son la dismutación de aldehídos y la oxidación ¹⁵¹ El papel fisiológico, aunque seguramente relacionado con el metabolismo de las especies anteriores, no está definitivamente asentado. Se está dedicando mucho esfuerzo a comprender el mecanismo de acción de esta clase de enzimas, las cuales tienen implicaciones obvias para el problema social del alcoholismo.

Cada unidad monómera de LADH contiene dos iones de zinc: uno coordinado a cuatro azufres de cisteína, el otro coordinado a dos azufre de cisteína, un nitrógeno de histidina y una molécula de agua. El primero no tiene un papel aparente en la catálisis; el segundo es esencial para la actividad catalítica. La estructura de rayos X de la enzima empobrecida en metal del hígado de caballo se ha resuelto a una resolución de 2.4 Å, y la de la holoenzima a 2.9 Å de resolución (Figura 2.34 Ver sección de placa de color, página C-6.). Muchas estructuras cristalinas también están disponibles para complejos binarios con sustratos, pseudosustratos o coenzimas, así como para complejos ternarios con coenzima y sustratos. ¹⁵² El panorama muy detallado que surge de dicha información estructural nos ha ayudado a entender cómo funciona LADH. Como será evidente a partir de la siguiente discusión, la elucidación de este mecanismo también revela alguna química fundamental importante.

Una propiedad clave de la enzima, establecida por los datos de rayos X, es la existencia de dos dominios proteicos en cada monómero que son relativamente libres de rotar entre sí. Las apo- y holoenzimas existen en la llamada forma abierta, mientras que la unión de la coenzima NADH induce la rotación de un dominio, dando como resultado la llamada forma cerrada ^153,154 (Figuras 2.34 y 2.35). El cierre lleva el ion zinc catalítico a una posición ideal para unirse al sustrato aldehído de tal manera que el grupo reactivo CH ₂ del anillo nicotinamida del NADH apunta hacia el carbono carbonilo (Figura 2.35).

Figura 2.35 - Dibujo esquemático de (A) el dímero LADH y (B) los dominios que constituyen el sitio activo de una subunidad. ¹⁵⁴

Las principales funciones del metal son así orientar el sustrato geométricamente y polarizar el enlace carbono-oxígeno. Aunque esta última tiene sentido químico obvio para la reacción de reducción de aldehído, ya que la polarización del enlace C=O facilita el ataque nucleofílico del hidruro en el carbono carbonilo, se espera que la coordinación de un alcohol a un metal disminuya la tendencia del alcohol a transferir hidruro a NAD ⁺ , a menos que el protón hidroxilo se libere tras la coordinación. ¹⁵⁵

\(\tag{2.23}\)

_{A menudo se ha cuestionado la formación de un ion alcóxido como intermedio, ya que el pK a del alcohol tendría que reducirse en aproximadamente 10 unidades tras la coordinación.} ¹⁵⁶ La posibilidad de que la transferencia de hidruro del alcohol al NAD ⁺ y la liberación de protones hidroxilo puedan ocurrir simultáneamente es atractiva, pero experimentos cuidadosos han demostrado que las dos etapas deben estar separadas cinéticamente. ¹⁵⁷ Resumimos aquí la información clave que conduce a una racionalización completa, aunque circunstancial, del comportamiento químico de la enzima.

1. Los perfiles de actividad versus pH ^156,158 tienen forma de campana, con k _cat aumentando con _un pK a por debajo de 7, alcanzando una meseta, y disminuyendo con _un pK a por encima de 11, y K _m aumentando con _un pK a de aproximadamente 9.
2. Los datos de rayos X muestran que el ion zinc es accesible al disolvente en la conformación abierta, mucho menos en la conformación cerrada cuando se une la coenzima reducida, e inaccesible cuando el sustrato se coordina con el metal en el complejo ternario, extruyendo todas las moléculas de agua del sitio activo. ¹⁵² Ninguno de los complejos tiene una molécula de agua coordinada como quinto ligando cuando sustratos o inhibidores están unidos al metal. El ion metálico es siempre de cuatro coordenadas y pseudotetraédrico. Los gráficos por computadora revelan más allá de toda duda que no hay espacio para un quinto ligando en el sitio activo, al menos en la forma cerrada.
3. Muchos (aunque no todos) datos espectroscópicos sobre derivados sustituidos con metal y sus complejos binarios y ternarios también se han interpretado como indicativos de un metal de cuatro coordenadas. ¹⁵⁹ Incluso el níquel (II) y el cobre (II), que tienen poca tendencia a adaptarse a un ambiente de ligando pseudotetraédrico, lo hacen en LADH, cuya estructura electrónica se asemeja a la de las proteínas azules (Figura 2.36). ¹⁶⁰

Figura 2.36 - Espectros electrónicos de alcohol deshidrogenasa hepática sustituida con cobre en el sitio catalítico (• • • •), ¹⁶⁰ junto con los espectros de azul (estrellacyanina, —) ¹⁶¹ y no azul (superóxido dismutasa, ———) ¹⁶² proteínas de cobre.

4. El sitio de unión al sustrato es realmente “creado” por el cierre de la proteína (Figura 2.34). Las especies reactivas quedan así atrapadas en un ambiente absolutamente anhidro. El aldehído cromofórico DACA ha sido ampliamente utilizado como un “indicador” de la polaridad del sitio de unión. Los grandes desplazamientos al rojo del ligando\(\pi\) -\(\pi\) * transición tras la unión indican que la polaridad del sitio es mucho mayor que en el agua; hay un aumento considerable adicional en la polaridad cuando NAD ⁺ en lugar de NADH se une en el complejo ternario. ¹⁶³

\(\tag{2.24}\)

5. Los espectros electrónicos del derivado sustituido con cobalto son característicamente diferentes cuando diferentes aniones están unidos al metal (Figura 2.37). ¹⁶⁴ Un intermedio complejo ternario catalíticamente competente muestra el patrón de absorción electrónico típico de los aductos aniónicos. ¹⁶⁶

Figura 2.37 - Espectros electrónicos de alcohol deshidrogenasa hepática sustituida con cobalto en el sitio catalítico. Complejo binario con NAD ⁺ (———); ¹⁶⁵ complejo ternario con NAD ⁺ y CI ^- (—); ¹⁶⁵ complejo binario con acetato (• • • • •); ¹⁶⁴ intermedio en la oxidación de alcohol bencílico con NAD ⁺ (—-—-—). ¹⁶⁶

6. _{A partir de mediciones de cinética extendida se ha propuesto un esquema de protonación (Figura 2.38) que da cuenta de los muchos valores pK a observados en diferentes condiciones.} ¹⁶⁷ Este esquema nuevamente requiere la formación de un intermedio alcóxido coordinado, pero tiene la ventaja de racionalizar de manera sencilla un patrón complejo. En esencia, el único grupo ácido-base relevante suministrado por la enzima es el agua coordinada con metales, que tiene _un pK a de 9.2 en la enzima libre (forma abierta). Tras la unión de NADH el pK _a aumenta a 11.2. _{Dado que la disociación de NADH es el último paso y limitante de la velocidad de la reacción de oxidación del alcohol, la disminución de k cat con este pK a se explica por una disminución en la tasa de disociación de NADH de la forma hidroxo.} Por otro lado, el pK _a de agua se disminuye a 7.6 tras la unión de NAD ⁺. Estos cambios bastante grandes en ambos sentidos se explican mejor por una marcada sensibilidad de la molécula de agua coordinada a la polaridad del ambiente, que, con la posible excepción de la forma no ligada que tiene un pK más o menos “regular” _un valor de 9.2, puede ser casi completamente anhidra y muy diferente de la del agua a granel. El anillo de nicotinamida no polar del NADH disminuye las interacciones electrostáticas globales de la molécula de agua, mientras que la carga positiva de NAD ⁺ las incrementa drásticamente. En este esquema, se prevé que las tasas de asociación de ambas coenzimas disminuyan (y, de hecho, hagan) con _un pK a de 9.2, se predice que la tasa de disociación de ^NAD+ disminuya (y hace) disminuya con _un pK a de 7.6, y se predice que la tasa de disociación de NADH disminuya con _{un pK a} de 11.2 (y, de hecho, es independiente del pH hasta y por encima de pH 10).

Figura 2.38 - Esquema de protonación para LADH y sus aductos con coenzimas y sustratos. ^157,167

La disminución de k _cat a pH bajo depende de una ionización que a su vez depende del sustrato. Este pK a debe ser el del alcohol coordinado; a _un pH demasiado Iowa, la desprotonación del alcohol coordinado se convierte en el paso limitante de la velocidad. Los valores pK _a observados para este proceso oscilan entre 6.4 para el etanol y 4.3 para el triftuoroetanol. Lo sorprendente para la química de soluciones acuosas, que el pK a de _un alcohol coordinado es menor que el pK a de _una molécula de agua coordinada, ahora se puede explicar en términos de la diferente polaridad de los dos aductos en LADH. En el complejo binario con NAD ⁺ (pK _a = 7.6), la molécula de agua aún está libre para interactuar a través de enlaces H con el disolvente y disipar parcialmente la carga electrostática. En el complejo ternario con cualquier alcohol, el grupo R puede impedir el acceso del disolvente a la cavidad, disminuyendo la constante dieléctrica del medio. Como consecuencia, se incrementa la polaridad del entorno. _{Es interesante especular que Nature podría haber elegido un ácido de Lewis más fuerte que un ion zinc coordinado a dos residuos cargados negativamente para disminuir el pK a de un alcóxido coordinado, pero luego el pK a del agua coordinada habría sufrido simultáneamente un paralelo y} posiblemente disminución aún más fuerte. En cambio, LADH proporciona un ambiente autorregulador que se adapta para disminuir el pK a de _un alcohol coordinado, una vez colocado correctamente, más que el de un agua coordinada. El ciclo catalítico completo para la reacción de deshidrogenación a pH alrededor de 7 se puede resumir de la siguiente manera (Figura 2.39):

1. El NAD ⁺ se une a la forma abierta que contiene agua de la enzima con una tasa de activación máxima. El pK _a de agua se disminuye a 7.6, pero el agua sigue siendo mayoritariamente sindicalizada.
2. Una molécula de alcohol neutro ingresa a la grieta entre los dos dominios y coordina el ion zinc desplazando la molécula de agua. La proteína aún está en forma abierta.
3. La rotación de dominios lleva la proteína a la forma cerrada, excluyendo todas las moléculas de agua residuales del sitio activo; el efecto combinado de la carga positiva de metal y de la carga positiva sin blindaje del anillo de nicotinamida disminuye el pK _a del alcohol coordinado por debajo de 7. Un protón es expulsado de la cavidad, posiblemente a través de una red de enlaces de hidrógeno de residuos proteicos.
4. La transferencia directa de hidruro se realiza desde el alcohol CH a la posición 4 del anillo de nicotinamida adecuadamente orientado. El complejo ternario resultante es un aducto de NADH-aldehído. La polaridad del sitio activo disminuye drásticamente.
5. El producto aldehído sale y es reemplazado por una molécula de agua neutra (su pK _a ahora es 11.2). Ahora pueden ingresar moléculas de agua adicionales a la grieta, favoreciendo la apertura parcial de la estructura.
6. La pérdida de contactos entre las dos mitades del canal favorece una apertura completa y luego la liberación de NADH, cuya tasa de disociación es máxima e independiente del pH.

Figura 2.39 - Posible ciclo catalítico de LADH.